艾滋病确诊，HIV抗体免疫印迹确认试验

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HIV抗体免疫印迹确认试验

1  适用范围

适用于MP生物医学亚太私人有限公司出品的人类免疫缺陷病毒（HIV1+2型）抗体免疫印迹试剂盒体外检测人血清（或血浆）中的HIV-1和HIV-2抗体。可用于HIV抗体初筛呈阳性结果的样品的确定检验。

2  原理

免疫印迹试验是将HIV－1病毒抗原通过十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳，由于蛋白分子大小不同而分离开来，然后再把这些已经分离的不同蛋白带转移到硝化纤维膜上，同时在膜的一端标记上人工合成的HIV－2病毒抗原特异蛋白。膜上还标记有内部参照带，以避免因操作失误造成假阴性结果，同时保证加样的正确性。

将可疑血清标本按1：1000稀释，与膜条充分接触一定时间，若有相应抗体就会与膜条上的抗原带相结合。通过洗膜，去除其他成分，与羊抗人IgG酶结合物反应。在底物作用下，膜条上呈紫色，表示为阳性反应。

3  试剂盒的组成

3．1硝化纤维膜                                                                                18条或36条

   膜上标记有HIV－1病毒分解蛋白、HIV－2包膜蛋白

   人工合成肽、内部参照。避光保持干燥     

3．2阴性对照                                                                                         1管

   经灭活正常人血清，不含乙肝病毒表面抗原、HIV－2、                 （80μl）

   HIV－1、丙肝病毒抗体。含有叠氮钠等防腐剂

3．3强阳性对照                                                                                         1管

   经灭活过人血清，含有高滴度HIV－1、HIV－2抗体，不含有         （80μl）

   乙肝病毒表面抗原、丙肝病毒抗体。含有叠氮钠等防腐剂

3．4弱阳性对照

   经灭活过人血清，只含有低滴度HIV－1抗体，不含有乙肝病毒         1管

   表面抗原、HIV－2抗体、丙肝病毒抗体，含有叠氮钠等防腐剂       （80μl）

3．5浓缩印迹缓冲液（10×）                                                                  1瓶

   经灭活过正常羊血清，含有叠氮钠等防腐剂                                        （20ml）

3．6浓缩洗液（20×）                                                                            1瓶

   含有Tween-20 的Tris液，内有叠氮钠等防腐剂                                 （70ml）

3．7浓缩酶结合物（1000×）                                                                     1管

   含有碱性磷酸酶的羊抗人IgG抗体结合物                                            （120μl）

3．8底物                                                                                                        1瓶

   含有5－溴－4－氯－3－吲哚磷酸盐和氯化硝基四氮唑蓝                        （100ml）

3．9印迹粉                                                                                                  10包

   脱脂奶粉                                                                                            （每包1g）

3．10反应槽                                                                                              2板或4板

                                                                                                              （每板9孔）

3．11镊子                                                                                                       1只

4  其他所需物品和仪器：

4．1摇床

4．2（新鲜的）蒸馏水或去离子水

4．  3一次性（玻璃或塑料）瓶用于准备TMB底物液

4．  4一次性手套

4．  5计时器

4．6  5％次氯酸钠或其他认可消毒液

4．  7适于盛装有可能受污染物品的容器

4．  8吸水纸

4．  9加样器（10μl、50μl、100μl、1ml）准确度±2％及一次性加样头

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5  试剂准备

5．1配置洗液：吸取1ml浓缩洗液（20×），加入19ml蒸馏水充分混合。

5．2配置印迹液：吸取1ml浓缩印迹液（10×），加入9ml蒸馏水混合；每20ml已稀释的印迹液加入1g新鲜的印迹粉，充分混匀。

5．3配置酶工作液：将酶浓缩液按1：1000比例加入印迹液中；例如：2μl酶浓缩液加入2ml印迹液中。（酶工作液必须现配现用）

5．4底物液：直接用干净的吸头加入槽中。

5．5每一条膜条需：洗液20ml，印迹粉0.25g，浓缩印迹液0.5ml，酶工作液2ml

6  实验程序

6．1．1按所需数量用镊子小心将膜条放入相应的槽中，注意有数字面朝上（包括强阳性对照、弱阳性对照和阴性对照）。

6．1．2在每槽中加入2ml洗液。

6．1．3将槽放置在摇床上至少5分钟（室温25±3℃），吸出废液。

6．1．4每槽加入2ml印迹液，再加入相应的样品或对照20μl。

6．1．5盖上盖子，室温（25±3℃）置于摇床摇1小时。

6．1．6小心揭去盖子,防止液体溅出,吸出废液；注意：不可重复使用吸头，以免造成交叉污染。

6．1．7每槽中加入2ml洗液洗膜5分钟，反复3次，弃去洗液。

6．1．8每槽加入2ml酶工作液，室温（25±3℃）置于摇床1小时。

6．1．9弃去酶工作液，重复步骤7。

6．1．10每槽加入2ml底物，置于摇床15分钟。

6．1．11弃去底物液，用蒸馏水清洗膜条数遍终止反应。

6．1．12用镊子小心将膜条置于吸水纸上吸干水分。

6．1．13将膜条转移至白纸上，对照说明书上的标准带进行判定。避光保存。

6．1．14详细记录下试验步骤、试剂批号、有效期、试验时间及标本有关资料

6．2过夜法

6．2．1按所需数量用镊子小心将膜条放入相应的槽中，注意有数字面朝上（包括强阳性对照、弱阳性对照和阴性对照）。

6．2．2在每槽中加入2ml稀释洗液。

6．2．3将槽放置在摇床上至少5分钟（室温25±3℃），吸出废液。

6．2．4每槽加入2ml印迹液，再加入相应的样品或对照20μl。

6．2．5盖上盖子，在室温（25±3℃）下置于摇床过夜（16－20小时）。

6．2．6小心揭去盖子，防止液体溅出，吸出废液，注意吸头不可重复使用，以免造成交叉污染。

6．2．7每槽中加入2ml洗液摇5分钟，反复3次，弃去洗液。

6．2．8每槽加入2ml酶工作液，室温（25±3℃）置于摇床30分钟。

6．2．9弃去酶工作液，重复步骤7。

6．2．10每槽加入2ml底物，置于摇床15分钟。

6．2．11弃去底物液，用蒸馏水清洗膜条数遍终止反应。

6．2．12用镊子小心将膜条置于吸水纸上吸干水分。

6．2．13将膜条转移至白纸上，对照说明书上的标准带进行判定。避光保存。

6．2．14详细记录下试验步骤、试剂批号、有效期、试验时间及标本有关资料

7  结果判定

7．1 HIV抗体阳性（＋）

有下列任何一项者，即可确认：

（1）至少有二条env带（gp160/gp120和gp41）出现

（2）至少有一条env带和p24带同时出现。

7．2 HIV抗体阴性（－）

无HIV抗体特异带出现。

7．3 HIV抗体可疑（±）

出现HIV特异性抗体带，但带型不足以确认阳性。

注：①env带指gp160、gp120、gp41(HIV－2型为gp140、gp105、gp36)

   gag带指p55、p24、p18（HIV－2型为p56、p26、p16）

   pol带指p65、p51、p31（HIV－2型为p68、p53、p34）

②上述标准为判读免疫印迹检测结果的基本原则，在实际工作中还应参照所用试剂的说明书综合判断。

③HIV抗体条带至少需二人核对后才能判定